کتابخانه سی دی ان ای

کتابخانه سی دی ان ای ( به انگلیسی cDNA library ) ترکیبی از قطعات cDNA کلون شده ( DNA مکمل ) وارد شده به مجموعه ای از سلول های میزبان هستند. این قطعات با یکدیگر بخشی از رونوشت ارگانیسم را تشکیل می دهند و به عنوان یک «کتابخانه» ذخیره می شوند. cDNA از mRNA ی موجود در هسته تولید می شود و در نتیجه تنها حاوی ژن های بیان شدهٔ یک ارگانیسم است. به طور مشابه، کتابخانه های cDNA خاص بافت نیز می تواند تولید شود. در سلول های یوکاریوتی، mRNA بالغ پیرایش شده است، از این رو cDNA ساخته شده فاقد اینترون ها می باشد و می تواند به آسانی در یک سلول باکتریایی بیان شود. از آنجایی که محصولات ژن ها به راحتی شناسایی می شوند، اطلاعات کتابخانه های cDNA یک ابزار قدرتمند و مفید می باشد؛ اما این کتابخانه ها فاقد اطلاعات مربوط به افزاینده ( enhancers ) ، اینترون و دیگر عناصر تنظیمی که در یک کتابخانه DNA ژنومی یافت می شوند، می باشند.
ساخت cDNA از mRNA بالغ یک سلول یوکاریوتی با استفاده از آنریم ترانس کریپتاز معکوس ( آنزیم رونوشت بردار معکوس ) انجام می شود. در یوکاریوت ها، یک دم پلی آ ( A ) ( متشکل از یک رشته بلند از نوکلئوتیدهای آدنین ) mRNA را از tRNAها و rRNA ها متمایز می کند و بنابراین می توان از آن به عنوان یک سایت آغازگر ( پرایمر ) برای رونویسی معکوس استفاده کرد. البته این مشکل وجود دارد که تمام رونوشت ها ناحیه دم پلی آ را ندارند، از جمله رونوشت های رمزگردان هیستون ها.
در ابتدا، mRNA استخراج شده و از مابقی RNAها تخلیص می گردد. چندین روش برای خالص سازی RNA وجود دارد مانند استخراج به روش ترایزول ( Trizol ) یا تصفیه به وسیله ستون. تصفیه به روش ستون با استفاده از رزین های پوشش داده شده با نوکلئوتیدهای الیگومری dT انجام می گیرد که در آن تنها mRNAهای دارای دم پلی آ به ستون متصل می شوند. مابقی RNAها شسته می شوند. سپس mRNA با استفاده از بافر شستشو شسته می شود و با کمی حرارت رشته mRNA از oligo - dT جدا می گردد.
هنگامی که mRNA خالص سازی می شود oligo - dT ( توالی کوتاهی از نوکلئوتید دئوکسی - تیمیدین ) به عنوان یک پرایمر مکمل به دم پلی آ متصل شده و یک انتهای آزاد ’۳ - OH فراهم می کند که می تواند توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس طویل شود تا رشته DNA مکمل را ایجاد کند. اکنون، mRNA توسط یک آنزیم RNase جدا می شود تا یک cDNA تک رشته ای ( sscDNA ) باقی بماند. این sscDNA با کمک DNA پلیمراز به یک DNA دو رشته ای تبدیل می شود. با این حال، DNA پلیمراز برای سنتز یک رشته مکمل، به یک انتهای آزاد ’۳ - OH نیاز دارد. این انتهای آزاد توسط خود sscDNA با ایجاد یک حلقه سنجاق سری در انتهای ۳' از طریق پیچش بر روی خود فراهم می شود. پلیمراز انتهای '۳ - OH را طویل می کند و بعد از آن حلقهٔ انتهای ’۳ با عملکرد قیچی مانند آنزیم نوکلئاز S1 باز می شود. سپس آنزیم های اندونوکلئاز محدودکننده و DNA لیگاز برای کلون کردن توالی به درون پلاسمید باکتریایی استفاده می شوند.