ساب کلونینگ

در زیست شناسی مولکولی، ساب کلونینگ ( subcloning ) تکنیکی است که برای انتقال یک توالی ویژهٔ DNA از یک وکتور والدی به یک وکتور مقصد استفاده می شود. ساب کلونینگ نباید با شبیه سازی مولکولی ( molecular cloning ) ، که یک تکنیک مرتبط است، اشتباه گرفته شود.
آنزیم های محدودکننده ( Restriction enzymes ) برای برش ژن دلخواه ( ژن ورودی ) از والد، مورد استفاده قرار می گیرند. ژن مورد نظر از بقیهٔ مولکول های DNA جدا شده و خالص می شود. یک روش متداول خالص سازی، جداسازی از طریق ژل ( gel isolation ) است. سپس تعداد رونوشت های ژن با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR ) افزایش می یابند.
به صورت همزمان، همان آنزیم محدودکننده ای که برای برش ژن استفاده شده بود، به منظور برش در ناحیه مقصد مورد استفاده قرار می گیرد. استفاده از آنزیم های محدودکننده یکسان به این دلیل است که انتهای چسبنده مکمل ( complementary sticky ends ) ایجاد شود که این در مراحل بعدی خود باعث تسهیل در اتصال ( ligation ) ژن مورد نظر می گردد. یک فسفاتاز ( معمولاً آلکالین فسفاتاز روده ای گاوی ( CAIP ) ) نیز برای جلوگیری از خوداتصالیِ ( self - ligation ) وکتور مقصد، اضافه می شود. سپس ژن مورد نظر ( insert ) و وکتور مقصد به همراه DNA لیگاز، با یکدیگر مخلوط می شوند. نسبت مولار ژن های ورودی به ژن های مقصد عموماً ۳ به ۱ است[ ۱] ؛ با افزایش غلظت ژن ورودی، خوداتصالی به میزان بیشتری کاهش می یابد. سپس اجازه داده می شود تا مخلوط واکنش گر برای مدت زمانی مشخص در یک دمای ویژه بماند. این باعث می شود ژن ورودی به راحتی با پلاسمید مقصد ترکیب شود. شرایط مناسب به منظور ترکیب ژن ورودی با پلاسمید، به اندازه رشته های در حال اتصال ارتباط دارد.
پلاسمید اغلب به یک باکتری ( مانند E. coli ) منتقل می شود. در حالت ایدئال زمانی که باکتری تقسیم می شود، پلاسمید هم باید همراه با آن تکثیر شود. در بهترین حالت، هر سلول باکتریایی باید چندین کپی از پلاسمید داشته باشد. بعد از اینکه تعداد قابل قبولی از کلونی های باکتریایی رشد کردند، DNA پلاسمیدی می تواند از آن ها استخراج شود.
برای اطمینان از اینکه تنها باکتری های ترنسفورم شده ( transformed bacteria: باکتری هایی که تنها حاوی پلاسمید مورد نظر ما هستند ) رشد کرده اند، در وکتور مقصد یک مارکر ژنی ( marker gene ) قرار داده می شود. وجود مارکر ژنی، امکان انتخاب باکتری های ترنسفرم شده را فراهم می سازد. ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک ( antibiotic resistance ) و همچنین ژن های بیوسنتز مواد مغذی ( nutrient biosynthesis ) از مارکرهای ژنی متداول هستند. به عنوان مثال، «مارکر ژنی» می تواند ژن مقاومت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین باشد. اگر باکتری ای که قرار بود پلاسمید دلخواه را دریافت کند، ژن مورد نظر را نیز دریافت کرده باشد، مارکر ژنی را نیز خواهد داشت.