میکروسکوپ فلوئورسانس

در اوایل قرن بیستم میلادی یکی از مهمترین مشکلات در مطالعه نمونه های زیستی و آلی عدم برهم کنش نور با این نمونه ها به دلیل شفافیت آنها بود. به این دلیل، میکروسکوپ های فلوئورسانس پا به عرصه گذاشتند که این مشکل را برطرف می کنند. این میکروسکوپ ها برای مشاهده نمونه به جای نور ضعیف بازتاب شده از نمونه به نور گسیل شده از مولکول های فلوئورسانس که نمونه را پوشانده اند ( در مرحله آماده سازی نمونه، مولکول های فلوئورسانس به نمونه می چسبند و سرتاسر آن را پوشش می دهند ) متکی هستند، [ ۱] . [ ۲] با وجود این دستاورد مهم، میکروسکوپ های فلوئورسانس دارای مشکلاتی نیز می باشند:[ ۳] ۱ ) پراش نور؛ ۲ ) عدم جمع آوری تمام نور فلوئورسانس گسیل شده توسط عدسی شیء میکروسکوپ؛ ۳ ) وجود نور اضافی پس زمینه که باعث تاری عکس های نهایی می شود؛ ۴ ) نور لیزری که برای برانگیخته کردن مولکول های فلوئورسانس استفاده می شود می تواند باعث آسیب نمونه شود.
در ادامه به حد بنیادی موجود در قدرت تفکیک ( resolution ) میکروسکوپ های فلوئورسانس ناشی از موارد ۱ و ۲ ذکر شده در بالا می پردازیم. در حالت ایدئال، در تصاویر حاصل از میکروسکوپ های فلوئورسانس، بهترین وضوح وقتی حاصل می شود که تصویر هر مولکول فلوئورسانس ( منبع نقطه ای نور ) به صورت یک نقطه باشد. اما به علت جمع آوری تنها قسمتی از نور گسیل شده از یک مولکول فلوئورسانس توسط عدسی شیء و پراش، تصویر حاصل یک الگوی گسترده به صورت یک دیسک مرکزی احاطه شده با چند حلقه ( Airy disk ) می باشد. به علاوه، در اکثر میکروسکوپ ها، به علت وجود ابیراهی الگوی متفاوتی حاصل می شود که با عنوان تابع پاسخ ضربه ( به انگلیسی: impulse response function ) یا تابع نقطه گستر ( ( point spread function ( PSF ) شناخته می شود.
تابع نقطه گستر یک میکروسکوپ نقش ویژه ای در تعیین قدرت تفکیک آن دارد. برای نمونه، یک مقیاس متداول برای قدرت تفکیک یک میکروسکوپ عبارت است از کمترین فاصله بین دو منبع نقطه ای نور ( مولکول فلوئورسانس ) که هنوز توسط میکروسکوپ به صورت دو منبع جداگانه قابل تفکیک هستند. معیار ریلی ( به انگلیسی: Rayleigh's criterion ) برای قدرت تفکیک بیان می دارد که کمترین فاصله بین دو منبع نوری قابل تفکیک برابر شعاع دیسک مرکزی الگوی پراش است. این فاصله عبارت است از:
d = 0. 61 λ N A که در آن λ طول موج نور فلوئورسانس و NA روزنه عددی ( numerical aperture ) است که مرتبط با زاویهٔ فضایی هست که توسط عدسی شیء پوشش داده می شود و بیان کننده توانایی این عدسی در جمع آوری نور می باشد. برای یک میکروسکوپ معمولی با λ=۵۰۰ nm و NA=۱٫۳، قدرت تفکیک پذیری تقریباً برابر ۲۰۰nm است.