توالی یابی به روش سنگر

توالی یابی سنگر یکی از روش های توالی یابی دی ان ای بر پایه خاتمه رشته دی اکسی نوکلئوتاید توسط دی ان ای پلیمراز در فرایند همانندسازی دی ان ای است که شرکت Applied Biosystems برای اولین بار تجاری کرد. [ ۱] [ ۲] فردریک سنگر و همکارانش در سال ۱۹۷۷ این روش را ابداع کردند و پرکاربردترین روش برای تقریباً ۳۹ سال است. اخیراً توالی یابی به روش «  ( NGS ) توالی یابی نسل بعدی» جایگزین توالی یابی به روش سنگر برای حجم بالاتر و تحلیل ژنوم خودکار شده است. اما روش سنگر کماکان کاربرد زیادی در پروژه های کوچکتر، درستی سنجی نتایج توالی یابی نسل بعدی دارد.
روش قدیمی خاتمه زنجیره دی ان ای نیاز به یک دی ان ای تک رشته ای، یک دی ان ای پرایمر، دی ان ای پلیمراز، دی اکسی نوکلئوتیدتری فسفات ( dNTPها ) و دی دی اکسی نوکلئوتیدتری فسفات تغییریافته دارد که دومی باعث می شود رشته دی ان ای طولانی نشود. این نوکلئوتایدهای خاتمه بخش یک گروه ۳' - OH که برای تشکیل پیوند فسفدیسیته بین دو نوکلئوتاید مورد نیاز است را کم دارند که سبب می شود دی ان ای پلیمراز پس از استفاده از ddNTP تکثیر را متوقف کند. این ddNTPs ممکن است به صورت رادیواکتیو یا فلئورسانت برای تشخیص در ماشین های خودکار برچسب گذاری شوند.
نمونه دی ان ای به چهار واکنش مجزا نقسیم می شود که هر چهار دئوکسی نوکلئوتاید نرمال ( dATP, dGTP, dCTP and dTTP ) و دی ان ای پلیمراز را دارد. در هر واکنش تنها یکی از دیدئوکسی نوکلئوتایدها ( ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP ) و باقی از نوکلئوتایدهای عادی افزوده می شود. دیدئوکسی نوکلئوتاید افزوده شده باید ۰٫۰۱ غلظت دئوکسی نوکلئوتاید متناظر را داشته باشد تا هم تعداد بخش های مناسبی از تمامی رشته تولید شود. به بیان دیگر ۴ واکنش برای آزمون هر چهار ddNTP نیاز است. پس از آن بخش های دی ان ای حاصل حرارت دِناتوره می شوند و براساس اندازه توسط ژل پلی آکریل آمید - اوره جدا می شوند.
در تصویر راست، فیلم اشعه ایکس به ژل تابانده شده است و نقاط سیاه بیانگر قسمت های دی ان ای با اندازه مختلف هستند. هر خط سیاه بیانگر بخشی از دی ان ای است که به علت قرارگیری دیدئوکسی نوکلئوتایدها ( ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP ) به اتمام رسیده است. از مکان نسبی نوارهای مختلف می توان برای خواندن رشته دی ان ای استفاده کرد.
گونه های محتلف توالی یاب های خاتمه زنجیره ای شامل برچسب زدن با نوکلئوتید حاوی فسفر رادیو اکتیو برای برچسب گذاری ایزوتوپی یا با استفاده از پرایمر نشاندار در سر ۵' با رنگ فلورسنت هستند. پرایمر رنگی امکان تعیین توالی در یک سیستم نوری به صورت سریع تر و مقرون به صرفه تر را فراهم می آورد. لروی هود و همکاران بهبود بعدی را[ ۳] [ ۴] را در ddNTPsهای برچسب گذاری شده داده و آغازگر مرحله توالی یابی با توان بالا و خودکار بودند. در این روش در ابتدا از مواد رادیو اکتیو استفاده می شد و بعدها شرکت فارمسیا ( سوئد ) در دستگاه تعیین توالی نیمه اتوماتیک ALF از تک رنگفلوئورسین ( Fluorescein ) و در دستگاه ALF Express از رنگ CY5 استفاده کرد. در هر دو دستگاه لازم بود نمونه ها درچهار خانه جداگانه ریخته شود و جداسازی با استفاده از ژل اکریل آمید انجام می شد.